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    Western Blot實驗操作及選購指南

    Western Blot的原理

    自1979年被建立以來,蛋白印跡已成為研究型實驗室的一種常規方法。Western Blot即蛋白質印跡法(免疫印跡試驗),是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。包含通過凝膠電泳來分離蛋白混和物,隨后電轉移到適當的膜(如PVDF)上。在蛋白轉移至PVDF膜后,它們可被染色以便觀察。被檢測物是蛋白質,“探針”是抗體,“顯色”用標記的二抗及底物。通過分析顯影的位置和顯影深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。這種方法能夠提供各個蛋白的分子量信息,并能區分異構體、選擇性加工產物及其它的翻譯后修飾形式。

    Western Blot的流程

    實驗器材

    操作步驟——1. 樣品制備

    對于Western  Blot實驗而言,樣品處理是關鍵步驟之一,獲得的蛋白樣品必須均質、可溶,并解離成單個多肽亞基,且盡量減少相互間的聚集,使其最終僅依賴本身的分子量大小進行分離。當目標蛋白的含量很低時,需要選取目標蛋白含量較高的組織或細胞器(如核抽提物),或者通過免疫沉淀等方式進行富集。提取過程中為保證蛋白的完整性還可以加入蛋白酶或磷酸酶抑制劑。

    準備進行western blot的樣品可分為細胞、組織、免疫沉淀或親和純化后的蛋白等。樣品為蛋白溶液時不需要進行提取,而樣品為細胞、組織或包埋組織等則需要根據樣品的特性對其進行提取。根據需求不同還可針對于細胞亞結構進行提取。

    貼壁細胞樣本的總蛋白提取

    1. 倒掉培養液,并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養液(或將瓶直立放置一會兒使殘余培養液流到瓶底然后再用移液器將其吸走)。

    2. 每瓶細胞加3 ml 4℃預冷的PBS(0.01M pH7.2~7.3)。平放輕輕搖動1 min洗滌細胞,然后棄去洗液。重復以上操作兩次,共洗細胞三次以洗去培養液。將PBS棄凈后把培養瓶置于冰上。

    3. 按1ml裂解液加10 μl PMSF(100 mM),搖勻置于冰上。(PMSF要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。)

    4. 每瓶細胞加400 μl含PMSF的裂解液,于冰上裂解30 min,為使細胞充分裂解培養瓶要經常來回搖動。

    5. 裂解完后,用干凈的刮棒將細胞刮于培養瓶的一側(動作要快),然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5 ml離心管中。(整個操作盡量在冰上進行。)

    于4 ℃下12000rpm離心5 min。(提前開離心機預冷)

    6. 將離心后的上清分裝轉移到0.5 ml的離心管中放于-20 ℃保存。

    哺乳動物組織樣本的總蛋白提取

    1. 將100 mg 組織剪切成小塊,加入適量的冰冷PBS 洗滌兩次后,4℃,700×g(3000 rpm) 離心3 min,棄上清。20 mg組織加入100 μl裂解液,置玻璃勻漿器冰上均質30~50次。(如使用組織勻漿機,則按照20 mg組織加入100 μl裂解液的比例加入裂解液。每個試管加入2個直徑2 mm的磁珠。將試管放入組織勻漿機中,60 HZ,300s。充分裂解后,10000 g離心5 min,取上清。)

    2. 最大速度渦旋震蕩10 sec,冰上放置20 min,期間取出震蕩3-5次,再于4℃, 12000 rpm 離心10 min,以沉淀組織或細胞碎片,取上清。

    生工相關產品——WB樣品制備

    RIPA 裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一種傳統的細胞組織快速裂解液。RIPA 裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用于常規的 WB、IP 等。按裂解強度可分成不同類型產品。

    產品編號

    產品名稱

    裂解強度

    C500005

    RIPA裂解液I

    C510006

    RIPA裂解液II

    C500007

    RIPA裂解液III

    C500008

    RIPA裂解液IV

    對于不同的物種組織、培養細胞或不同細胞結構蛋白,您可以選擇更有針對性的試劑盒。如果您需要節省實驗步驟,加快速度,還可選擇一步法蛋白提取試劑盒。

    不同物種、組織蛋白抽提試劑盒

    細胞不同部位蛋白抽提試劑盒

    產品編號

    產品名稱

    產品編號

    產品名稱

    C510003

    動物全蛋白提取試劑盒

    C510002

    膜蛋白、核蛋白和胞質蛋白抽提試劑盒

    C500053

    植物蛋白提取試劑盒

    C510005

    膜蛋白和胞質蛋白抽提取劑盒

    C600596

    細菌總蛋白提取試劑盒

    C510001

    細胞和蛋白/漿蛋白抽提試劑盒

    C500022

    一步法動物細胞活性蛋白提取試劑盒

    C500051

    胞質和線粒體蛋白提取試劑盒

    C510004

    一步法植物活性蛋白提取試劑盒

    C500009

    細胞核蛋白質提取試劑盒

    C500023

    一步法細菌活性蛋白提取試劑盒

    C500049

    膜蛋白提取試劑盒

    C500026

    一步法酵母活性蛋白提取試劑盒

    C500073

    亞細胞結構蛋白提取試劑盒

    C500058

    石蠟包埋組織蛋白提取試劑盒

    對細胞進行裂解后,與目標蛋白一起釋放出來的還有蛋白酶和磷酸酶,他們會水解蛋白為多肽或氨基酸。此過程會導致許多重要蛋白的流失,進而嚴重地影響下游實驗,因此需要在細胞的裂解過程中加入相應的蛋白酶或磷酸酶抑制劑,從而確保目標蛋白的完整性。

     

    蛋白酶抑制劑

    產品編號

    產品名稱

    概述

    C510022

    10% AEBSF溶液

    不可逆的絲氨酸蛋白酶抑制劑,可以保留細胞內成分活性,安全無毒,完全可以取代PMSF

    C600387

    100×蛋白酶抑制劑復合物,用于哺乳動物細胞

    本產品提供的蛋白酶抑制劑復合物含有廣泛的蛋白酶抑制活性,如絲氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、金屬蛋白和氨基多肽等蛋白酶抑制劑。

    提供的系列產品可以分別適用于不同物種中蛋白質的提取。

    C600384

    100×蛋白酶抑制劑復合物,用于植物細胞

    C600382

    100×蛋白酶抑制劑復合物,用于真菌/酵母細胞

    C600380

    100×蛋白酶抑制劑復合物,用于細菌細胞,無EDTA

    C600381

    100×蛋白酶抑制劑復合物,用于細菌細胞,含EDTA

    磷酸酶抑制劑

    產品編號

    產品名稱

    概述

    C500017

    100×磷酸酶抑制劑復合物I

    抑制酸、堿性和酪氨酸磷酸酶的活性,適合于動物細胞或組織蛋白的提取,最大程度地保持蛋白酶磷酸化。

    C500018

    10×磷酸酶抑制劑復合物II

    抑制堿性、絲氨酸、蘇氨酸以及PP1、PP2A磷酸酶的活性,適合于動物細胞或組織蛋白的提取,最大程度地保持蛋白酶磷酸化。

    C500019

    10×磷酸酶抑制劑復合物III

    抑制酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸以及PP1、PP2A磷酸酶的活性,適合于動物細胞或組織蛋白的提取,最大程度地保持蛋白酶磷酸化。

    蛋白定量

    蛋白定量是做WB實驗的基礎。

    蛋白定量的目的是:保證同一組中的不同樣本的蛋白總量保持一致,只有這樣,WB結果的內參、灰度等數據才可信。否則實驗數據沒有參考價值。

    生工提供三種不同方法的蛋白定量檢測,分別是 Bradford 法、BCA 法和 Lowry 法。Lowry 法是比較公認的,很多國標、GMP 標準都是用 Lowry 測定的。 BCA 法和 Bradford 法操作比較簡便,耗時少,Bradford法在實驗室中用的較多,BCA 法的準確性高于 Bradford法。

    這些方法各有優缺點。應該按照具體實驗選擇不同的實驗方法進行蛋白定量。

    BCA法蛋白定量

    1. 根據樣品數量,按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配制適量BCA工作液,充分混勻。BCA工作液室溫24小時內穩定。

    2. 完全溶解蛋白標準品,取10ul稀釋至100 ul,使終濃度為0.5 mg/ml。蛋白樣品在什么溶液中,標準品也宜用什么溶液稀釋。但是為了簡便起見,也可以用0.9% NaCl或PBS稀釋標準品。

    3. 將標準品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ul加到96孔板的標準品孔中,加用于稀釋標準品的溶液補足到20 ul。

    4. 加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中,加用于稀釋標準品的溶液至20 ul。

    5. 各孔加入200 ul BCA工作液,37℃放置30分鐘。注: 也可以室溫放置2小時,或60℃放置30分鐘。BCA法測定蛋白濃度時,吸光度會隨著時間的延長不斷加深。并且顯影反應會因溫度升高而加快。如果濃度較低,適合在較高溫度孵育,或延長孵育時間。

    6. 測定562 nm波長處吸光值,540-595 nm之間的波長也可接受。根據標準曲線計算出蛋白濃度。

     

    生工相關產品

    產品編號

    產品名稱

    C503041

    改良型Bradford蛋白濃度測定試劑盒

    C503021

    BCA蛋白質定量檢測試劑盒

    C504031

    Lowry法蛋白濃度測定試劑盒

    C503071

    非干擾型蛋白濃度測定試劑盒

    凝膠電泳

    Western Blot通常使用SDS-PAGE進行電泳。根據自身蛋白的分子量選擇SDS-PAGE的濃度,如蛋白分子量未知可以選擇梯度凝膠。

    PAGE 膠的制備是實驗的關鍵,而對于新手而言,傳統手工配膠即繁瑣又需要一定的技術要求。所以,更推薦直接使用預制膠,如果您希望有更經濟節約的選擇,還可使用 PAGE 膠快速制備試劑盒。

    10% SDS-PAGE 自制膠電泳步驟

    1. 根據蛋白的分子量確定好SDS-PAGE膠的濃度,裝配好灌膠的模具。

    2. 進行分離膠的配置,取一個燒杯,按照配方加入適量的聚丙烯酰胺溶液,10% SDS,分離膠緩沖液,混勻。加入適量的過硫酸銨和TEMED,輕輕攪拌(注:不要產生氣泡),將此液體緩慢加入到模具內。

    3. 加入分離膠后輕輕在分離膠溶液上覆蓋上水。

    4. 等待30~60 min,待凝膠聚合后,分離膠和水層出現一個清晰的界面,吸盡分離膠上的水。

    5. 進行濃縮膠的配置,取一個燒杯,按照配方加入適量的聚丙烯酰胺溶液,10% SDS,濃縮膠緩沖液,混勻。按照配方加入適量的過硫酸銨和TEMED,輕輕攪拌(注:不要產生氣泡),將此液體緩慢加入到分離膠的上面,直至灌滿,將梳子插入凝膠內(保證梳子齒末端沒有氣泡)。

    6. 等待30 min左右,待凝膠聚合后小心拔出梳子,將制好的凝膠及玻璃板放入電泳槽內并組裝好。

    7. 將電泳緩沖液加入內外槽中,使凝膠的上下兩端均能浸泡在電泳緩沖中。

    8. 將制備好的樣品與上樣緩沖液按比例混合,95 ~100 加熱3~5 min,取15 ul(可根據試驗情況進行調整)將樣品加入到凝膠孔中,同時必須在同一片膠的孔中加入蛋白marker作為參照。

    9. 接通電源進行電泳,觀察 marker,待 maker顯示的目標蛋白與其他蛋白明顯分離停止電泳,一般情況下是等溴酚藍標記的樣本跑出凝膠,目標蛋白的分子量不同電泳停止的時間不同,視實驗而定。

    生工相關產品——預制膠

    Precast-GLgel  預制膠用玻璃板作為材質,結合專利的緩沖液,效果完全達到并超越傳統手工 PAGE 膠水平;膠強韌有效防止斷裂;能兼容 Bio-Rad 標準的市面大部分電泳槽;電泳時間可短至 30 分鐘,且凝膠盒可徒手輕松打開,無需起撬工具。

    變性電泳預制膠

    產品編號

    產品名稱

    泳道

    C621100

    Precast-GL變性PAGE電泳預制膠7.5%

    10孔

    C621101

    Precast-GL變性PAGE電泳預制膠10%

    10孔

    C621102

    Precast-GL變性PAGE電泳預制膠12%

    10孔

    C621103

    Precast-GL變性PAGE電泳預制膠15%

    10孔

    C621104

    Precast-GL變性PAGE電泳預制膠4-15%

    10孔

    C621105

    Precast-GL變性PAGE電泳預制膠4-20%

    10孔

    非變性電泳預制膠

    產品編號

    產品名稱

    泳道

    C601100

    Precast-GL非變性PAGE電泳預制膠,7.5%

    10孔

    C601101

    Precast-GL非變性PAGE電泳預制膠,10%

    10孔

    C601102

    Precast-GL非變性PAGE電泳預制膠,12%

    10孔

    C601103

    Precast-GL非變性PAGE電泳預制膠,15%

    10孔

    C601104

    Precast-GL非變性PAGE電泳預制膠,4-15%

    10孔

    生工相關產品——凝膠制備試劑盒

    BBI品牌凝膠預混液,凝膠速度快,使用方便,提供了配制PAGE膠所需的各種試劑,用戶只需自備制膠器具和蒸餾水,即可配制PAGE膠。

    產品編號

    產品名稱

    包裝規格

    C631100

    SDS-PAGE變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒

    100ml,可配30~50片膠

    200ml,可配80~100片膠

    C631101

    Native-PAGE非變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒

    100ml,可配30~50片膠

    200ml,可配80~100片膠

    生工相關產品——電泳與上樣緩沖液

    產品編號

    產品名稱

    包裝規格

    C520001

    10×蛋白電泳緩沖液

    500ml

    C508320

    5×蛋白質加樣緩沖液

    1ml

    生工相關產品——蛋白Marker

    預染蛋白Marker

    產品編號

    產品名稱

    C610011

    TureColor蛋白預染Marker,雙色

    C610012

    RealBand蛋白預染Marker,雙色

    C610013

    RealBand蛋白預染Marker,常規范圍,3色

    C620014

    RealBand蛋白預染Marker,高范圍,3色

    C610015

    BlueAQUA蛋白預染Marker,單色

    C610016

    RealBand蛋白預染Marker,寬范圍,3色

    非預染蛋白Marker

    產品編號

    產品名稱

    C600201

    蛋白非預染Marker I,低分子量范圍

    C600523

    蛋白非預染Marker II,中分子量范圍

    C600524

    蛋白非預染Marker III,中分子量范圍

    C600525

    蛋白非預染Marker IV,中分子量范圍

    轉膜

    轉膜是將蛋白質從聚丙烯酰胺凝膠轉移到膜上的過程。轉膜的方法可分為半干轉和濕轉,濕轉法轉膜效率較高,使用轉膜液多,轉膜時需要冷卻,半干轉轉膜時間短,需要的轉膜液少,不適合轉移高分子量蛋白質。

    印記膜可以選擇PVDF膜和NC膜。PVDF膜與目的蛋白結合能力較高,靈敏度高,不易破碎,可適用于再次標記(使用前需要浸泡在甲醇中激活)。NC膜不需要甲醇激活但易破碎。膜的規格有0.45 μm和0.2 μm兩個規格,大于20 kD的蛋白可用0.45 μm的膜,小于20 kD的蛋白要用0.2 μm的膜。

    生工相關產品——印記膜

    產品編號

    產品名稱

    孔徑

    規格

    F619511

    硝酸纖維素印跡膜(NC印跡膜)

    0.22um

    20cm×20cm

    F619512

    硝酸纖維素印跡膜(NC印跡膜)

    0.22um

    26cmx3m

    F619536

    PVDF印跡膜

    0.45um

    10cmx10cm

    F619534

    PVDF印跡膜

    0.45um

    20cmx20cm

    F619537

    PVDF印跡膜

    0.45um

    30cmx3m

    PVDF膜濕轉步驟

    1. 準備好轉膜液,將膠浸于轉膜緩沖液10 min左右。

    2. 根據膠的大小剪PVDF膜(使用前需要用甲醇處理)和濾紙,放到轉膜緩沖液中平衡10 min左右。

    3. 裝配轉膜,在海綿上放置3層已經用轉膜液浸泡過的濾紙,放置膠,放置處理好的PVDF膜,放置3層已經用轉膜液浸泡過的濾紙,放置海綿,注意每層之間都不能有氣泡,用轉膜儀中的支架夾住。(膠位于負極)

    1. 將轉膜“三明治”放置到轉膜槽中,加轉膜緩沖液,將轉移槽置于冰浴中。插上電極,根據蛋白分子量確認轉膜的電壓/電流,時間。

    2. 轉膜結束后,切斷電源,取出PVDF膜。轉膜后可能分不清膜的方向,可在膜上剪角,有利于判斷膜的方向。

    生工相關產品——轉膜緩沖液

    產品編號

    產品名稱

    包裝規格

    C520003

    10×印記膜轉印緩沖液

    500ml

    C520039

    10×高分子量印記膜轉印緩沖液

    2×500ml

    封閉及免疫雜交

    為了防止抗體和膜非特異性的結合,要將除目的蛋白外其他無結合蛋白位置封閉起來,防止后面一抗非特異性結合產生較深背景。常用封閉物有脫脂奶粉和 BSA(稀釋于不同的緩沖液中),但不同的抗原-抗體反應,封閉條件均不相同。

    封閉后,目標蛋白便與特異性的一抗進行免疫反應,一抗可以是標記的,也可以是非標記的。標記的一抗與免疫原結合后,可直接進行檢測(直接法),降低了背景和非特異性結合,但信號較弱。非標記的一抗配合標記的二抗使用(間接法),對信號有級聯放大作用,可以增加靈敏性和信噪比。二抗既可標記放射性同位素,也可標記染料或其他分子,或與酶偶聯。常用的酶包括堿性磷酸酶(AP)和辣根過氧化物酶(HRP),通過與底物反應產生光信號。

    封閉及免疫雜交流程

    1. 用適量的TBS/PBS洗已經轉好的膜,室溫,放到搖床上晃動。

    2. 將膜置于約25 ml封閉緩沖液中1 h,室溫,置于搖床上晃動。

    3. 用15 ml TBS/T或PBS/T洗膜三次(每次約5 min)。

    4. 加入稀釋過的一抗,室溫孵育1~2 h或4 ℃過夜,緩慢晃動。

    5. 用15 ml TBS/T或PBS/T洗膜三次(每次約5 min)。

    6. 加入稀釋過的二抗,室溫孵育1 h,緩慢晃動

    7. 用15 ml TBS/T或PBS/T洗膜三次(每次約 5min)。(注:最后一次要用不含Tween的溶液清洗)    

    注:實驗的條件可根據實驗情況進行調整。

    生工相關產品——封閉及雜交

    封閉液

    產品編號

    產品名稱

    包裝規格

    C520035

    WB BSA封閉液體(1× in PBS)

    250 ml

    C500036

    WB   BSA封閉液體(1×   in TBS)

    250   ml

    C530040

    WB無蛋白封閉液, 2%

    500 ml

    C520041

    WB無蛋白封閉液, 1% in 1× PBS

    500   ml

    C510042

    WB無蛋白封閉液, 1% in 1× TBS

    500 ml

    C520013

    WB脫脂奶粉封閉液(2× in PBS)

    500   ml

    漂洗液

    產品編號

    產品名稱

    包裝規格

    C520002

    10× TBS WB漂洗液

    500 ml

    C520004

    10×   PBST WB漂洗液

    2 ×   500 ml

    C510008

    10× PBS WB漂洗液

    2 × 500 ml

    C520009

    10×   TBST WB漂洗液

    500   ml

    生工相關產品——抗體

    封閉后,目標蛋白便與特異性的一抗進行免疫反應,一抗可以是標記的,也可以是非標記的。標記的一抗與免疫原結合后,可直接進行檢測(直接法),降低了背景和非特異性結合,但信號較弱。非標記的一抗配合標記的二抗使用(間接法),對信號有級聯放大作用,可以增加靈敏性和信噪比。二抗既可標記放射性同位素,也可標記染料或其他分子,或與酶偶聯。常用的酶包括堿性磷酸酶(AP)和辣根過氧化物酶(HRP),通過與底物反應產生光信號。

    生工抗體種類齊全:

    標簽抗體:HIS,GST,FLAG,HA,MYC,GFP等高性價比抗體。

    內參抗體:ACTB(動物),ACTIN(植物),GAPDH,TUBB3,HIST1H3A(核內參)等高質量抗體。

    一抗:P53,BCL2,ERK1/2,EGF,TNF等兩萬種人類蛋白抗體。

    二抗:多種標記 HRP,Biotin,AP,FITC,PE,Cy5,Alexa Flour 488,TRITC 等,抗多種屬人,兔,大鼠,小鼠,豬,雞等全套二抗。

     

    顯色、顯影

    顯影的方法包括化學發光法以及生色底物顯影法進行實驗,并通過膠片或影像系統(CCD)收集。因為二抗上標記分為有HRP(辣根過氧化物酶)以及AP(堿性磷酸酶),兩種二抗可供選擇的方法也不同。

    • 標記HRP(辣根過氧化物酶)的二抗:

    化學發光底物:一般使用ECL發光法進行實驗,ECL中含有H2O2和魯米諾,在HRP(辣根過氧化物酶)的作用下,發出熒光來。

    生色底物:HRP的生色底物顯影有DAB,4-CN ,CN/DAB,AEC和TMB等。

    • 標記AP(堿性磷酸酶)的二抗:

    AP的生色底物:BCIP,NBT和INT。

    以DAB顯影標記HRP的二抗步驟

    1. 經二抗標記及清洗過的膜放在陰暗處。顯影前,配置新鮮的DAB顯影液并充分混勻。

    2. 在陰暗處將顯影液加入膜上,將膜覆蓋。37℃低速震蕩反應10 min左右即可。這時淺棕色的條帶出現。

    3. 倒掉反應液,雙蒸水沖洗條帶3~4次,自然干燥。照像記錄實驗結果。

     

    生工相關產品——顯色、顯影

     

    化學顯色試劑及試劑盒

    產品編號

    產品名稱

    包裝規格

    C520017

    辣根過氧化氫酶DAB顯色試劑盒

    能用于5張膜

    C510025

    WTMB顯色試劑

    能用于5張膜

    C520019

    NBT/BCIP堿性磷酸酶顯色試劑,藍色

    能用于5張膜

    C510032

    NBT/BCIP堿性磷酸酶顯色試劑,紫色

    能用于5張膜

    C500033

    INT/BCIP堿性磷酸酶顯色試劑,棕紅色

    能用于5張膜

    C520020

    AEC顯色試劑盒

    能用于5張膜

    C520024

    4CN顯色試劑盒

    能用于5張膜

    化學發光試劑

    產品編號

    產品名稱

    包裝規格

    C500044

    高靈敏ECL發光試劑

    100   ml/25 ml

    顯影試劑及耗材

    產品編號

    產品名稱

    包裝規格

    C500045

    X線暗盒

    1個

    C500046

    X光膠片

    100張

    C500047

    定影粉

    10包

    C500048

    顯影粉

    10包

    膜的再生

    在 Western Blot 中,如果要使用Actin、Tubulin 等表達量相對穩定的蛋白作為參照,或檢測其它蛋白進行比較。通常情況下,可以在染膜過程中將印記膜進行裁剪,將目的蛋白與內參蛋白分開,分別孵育不同的抗體。

    也可以通過使用蛋白印跡膜再生液中特殊成分解離一抗二抗與印跡膜上抗原的結合從而去除一抗二抗,即可非常方便地重新利用同一張膜檢測其它蛋白。

    與重新跑一個 SDS-PAGE 膠比較,不僅省時省力,而且可以消除重新上樣而帶來的誤差,使可比性更強。操作簡單快速,室溫進行,最快 20~30 min 就可以完成全過程。

    生工相關產品——膜再生

    產品編號

    產品名稱

    包裝規格

    C520012

    5×一抗/二抗清除液

    100 ml

    C500031

    5×蛋白印跡膜再生液(強)

    20 ml

    C510036

    5×蛋白印跡膜再生液(溫和)

    20 ml

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